本研究利用BCPDA進(jìn)行固相TRF IA研究,它克服了解離增強(qiáng)體系需增強(qiáng)溶液、易受環(huán)境銪離子污染、只能液相測(cè)量等缺點(diǎn),簡(jiǎn)化了測(cè)量步驟。結(jié)合BCPDA標(biāo)記BSA,研究標(biāo)記過(guò)程中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。為T(mén)RF IA體系提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù) 。材料和方法

　　1　材料

　　1. 1　儀器　分光光度計(jì),核酸蛋白檢測(cè)儀, 磁力攪拌器, pH22酸度計(jì), 層析柱，凱氏定氮儀，半自動(dòng)定氮儀 。

　　2. 2 　試劑　BCPDA (自合成) , 99. 999%Eu2 03 (自制) ,牛血清白蛋白, SephadexG250葡聚糖, 三羥甲基胺基甲烷(超級(jí)純) ,考馬斯亮藍(lán)G2250  ,無(wú)水碳酸鈉和無(wú)水碳酸氫鈉等試劑均為市售分析純以上。相關(guān)緩沖溶液均自制。實(shí)驗(yàn)用水:去離子水。

　　2　方法

　　2. 1　標(biāo)記反應(yīng)　室溫下,蛋白質(zhì)在0. 1mol/LpH = 9. 1的碳酸鹽緩沖液中衍生后,用二甲基甲酰胺(DMF)溶液將最新制備的BCPDA溶解,分幾份以1min間隔加入,同時(shí)連續(xù)渦流旋轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)溶液,室溫?cái)嚢?0min反應(yīng)結(jié)束。

　　2. 2 　分離純化　標(biāo)記反應(yīng)液中除有一部分BCPDA與蛋白質(zhì)結(jié)合外,還存在游離狀態(tài)的BCP2DA,將標(biāo)記反應(yīng)液通過(guò)凝膠層析柱,將結(jié)合的BCP2DA與游離的BCPDA加以分離,第一峰為結(jié)合峰,第二峰為游離BCPDA峰。在核酸蛋白儀280nm監(jiān)測(cè)下,收集結(jié)合峰部分的溶液。

　　2. 3　BCPDA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制　稱(chēng)取一定量BCP2DA用DMF溶解,用pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖溶液稀釋成一定濃度,配制成BCPDA標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。

　　2. 4　溶液中BCPDA含量測(cè)定　①利用BCPDA在325nm的特征吸收,其消光系數(shù)為1. 5 ×10⁴mol/L^-1 ·m^-1 ,計(jì)算BCPDA的濃度,公式為: BCPDA濃度(C) =吸光度(A) / (比色皿厚度×消光系數(shù)) ×稀釋倍數(shù),本實(shí)驗(yàn)中: C = A / (1cm ×1. 5 ×104mol/L^-1m^-1) ×稀釋倍數(shù); ②將BCPDA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用pH= 9. 1 碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液,pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英吸收池測(cè)其在325 nm處A值,做出工作曲線。同法測(cè)定樣品,在對(duì)應(yīng)工作曲線上查出樣品中的BCPDA濃度。

　　2. 5　BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制　稱(chēng)取一定量BSA用乙醇溶解,用pH = 9. 1的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成一定濃度,備用。

　　2. 6　考馬斯亮藍(lán)染色劑配制　稱(chēng)取0. 020g考馬斯亮藍(lán)G2250溶于95% 10mL 乙醇,加85%磷酸20mL,加去離子水稀釋至200mL 。

　　2. 7　考馬斯亮藍(lán)染色法BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制　取不同體積的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液, 分別加入10mL 容量瓶,用Tris2HCl緩沖液加到1mL,加染色液定容至刻度,立即搖勻,室溫放置10min,測(cè)595nm吸光度。

　　2. 8　考馬斯亮藍(lán)染色法BSA—BCPDA溶液配制　從反應(yīng)瓶中取一定量反應(yīng)液至5mL 容量瓶,加Tris2HCl緩沖液到1mL,再加入考馬斯亮藍(lán)G2250染色液到刻度,室溫放置10分鐘,測(cè)595nm吸光度。

結(jié)果與討論

　　1　BSA的吸收光譜性質(zhì)

　　分別用pH = 9. 1 碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0NH4HCO3 緩沖液, pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液分別將BSA儲(chǔ)備液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英池測(cè)其在280nm處吸光值。三種緩沖液稀釋BSA吸光值與其濃度(1028 ～1026 mol/L)之間呈良好線性關(guān)系。

　　2　BCPDA的結(jié)構(gòu)

從BCPDA 的結(jié)構(gòu)上看,它含有兩個(gè)磺酰氯基團(tuán),可在溫和條件下與蛋白質(zhì)的游離氨基共價(jià)結(jié)合。它含有的異芳香基氮和兩個(gè)羧基共同構(gòu)成了與銪離子螯合的部位。以BCPDA2Eu3 +螯合物標(biāo)記蛋白質(zhì)形成了性質(zhì)十分穩(wěn)定的熒光螯合物,經(jīng)紫外光激發(fā)能夠產(chǎn)生具有較高量子產(chǎn)率、較大Stokes位移、較窄發(fā)射譜帶、較長(zhǎng)熒光壽命( 10～1000μs)的熒光。其結(jié)構(gòu)如圖。

　　3　BCPDA的吸收光譜

　　將BCPDA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用pH = 9. 1碳酸鹽緩沖液, pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液, pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖液稀釋至不同濃度,置1cm ×1cm石英吸收池測(cè)其在280、325 nm A 值,三種緩沖液稀釋的BCPDA與其濃度(1026 ～1024 mol/L)之間呈良好線性關(guān)系,主要吸收光譜峰為232. 95、291. 58、325. 04nm。

　　4　BCPDA在280 nm處吸收干擾BSA測(cè)定

　　蛋白質(zhì)含量測(cè)定在TRFIA標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中涉及到標(biāo)記比的計(jì)算,監(jiān)測(cè)標(biāo)記反應(yīng)過(guò)程,標(biāo)記條件控制,因此蛋白含量的測(cè)定及其準(zhǔn)確性、靈敏性尤為重要。液相TRF IA 體系應(yīng)用EDTA 等雙功能螯合劑在280nm 處并未干擾蛋白質(zhì)的特征吸收, 可采用280nm處紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。而在新型雙功能螯合劑BCPDA 基礎(chǔ)上建立起來(lái)的固相體系,BCPDA與蛋白質(zhì)均在280nm處有較強(qiáng)吸收,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在280nm處的特征吸收緣于水解生成的大量氨基酸及苯環(huán)結(jié)構(gòu),而從BCPDA的分子結(jié)構(gòu)式來(lái)看同樣存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)并含羧基,所以紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量并不適用固相體系。

　　5　考馬斯亮藍(lán)G2250染色法測(cè)蛋白質(zhì)含量對(duì)比實(shí)驗(yàn)

　　將同樣濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和BSA2BCPDA 標(biāo)記反應(yīng)液用考馬斯亮藍(lán)G2250 染色法測(cè)蛋白質(zhì)含量,對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。結(jié)果表明,在1. 0～8. 0μg/mL濃度范圍內(nèi),BCPDA未干擾BSA測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)也在5. 0～40μg/mL濃度范圍內(nèi)進(jìn)行了研究,BSA 與BSA2BCPDA 溶液的A 值具有較好的一致性,符合比爾定律,滿足標(biāo)記監(jiān)測(cè)要求。

6   層析后的BSA2BCPDA標(biāo)記液蛋白質(zhì)含量檢測(cè)從所收集的純化反應(yīng)液中,用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè),并與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,查出相應(yīng)蛋白質(zhì)含量, 計(jì)算回收總量。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同樣品(BCPDA /自由氨基)的BSA2BCPDA中BSA含量,結(jié)果如表2。

　7　緩沖溶液選擇

　　實(shí)驗(yàn)比較了用pH = 7. 8 Tris2HCl、pH = 9. 1NH4HCO3、pH = 9. 1碳酸鹽、pH = 8. 0 NH4HCO3 緩沖液作為測(cè)定溶劑體系,發(fā)現(xiàn)使用pH = 7. 8 Tris2HCl緩沖溶液的工作曲線線性好于后三者。

　　8　相關(guān)樣品參數(shù)

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了用1. 5cm ×25cm 層析柱, 不同(BCPDA /BSA自由氨基) 投料比的標(biāo)記物標(biāo)記比(BSA mol/BCPDA mol)和BSA 回收率(% ) (見(jiàn)表3) 。BCPDA 標(biāo)記BSA 反應(yīng)最高蛋白質(zhì)回收率為54. 85%,初步推測(cè)標(biāo)記比隨BCPDA量增加而增大。

　9　BCPDA2BSA2 Eu3 +的螯合反應(yīng)及熒光光譜

　　將一定濃度的BCPDA2BSA液中加入含有Eu3 +的Tris2HCl緩沖液,按一定倍數(shù)稀釋,于37℃恒溫育0. 522h,使BCPDA與Eu3 +發(fā)生螯合反應(yīng),室溫穩(wěn)定1h后用337. 1nm 激發(fā),可測(cè)得銪離子熒光特征峰589、611nm。

結(jié)　　論

　　( 1)紫外吸收法不適合固相TRFIA 體系BSA2BCPDA中蛋白質(zhì)的測(cè)定。

　　(2)實(shí)驗(yàn)研究了在1027 ～1025 mol/L BCPDA標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入適量考馬斯亮藍(lán)染色液時(shí), 595 nm處未見(jiàn)明顯吸收。

　　(3)用考馬斯亮藍(lán)G2250染色法測(cè)定BSA2BCPDA中的BSA,在本實(shí)驗(yàn)條件下,工作曲線范圍為0. 50～40. 0μg/mL,曲線回歸方程為: Y =0. 00032 +0. 0015X, r=0. 9996。檢測(cè)下限以3σ/ r計(jì)算,為0. 35μg/mL ( n =9) , RSD <7. 8% 。該法操作簡(jiǎn)便迅速,具有消耗樣品量少,干擾程度小,靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。　(4)將考馬斯亮藍(lán)染色法用于固相TRF IA標(biāo)記物中蛋白質(zhì)測(cè)定,對(duì)多苯環(huán)螯合物、配位體與蛋白質(zhì)連接研究具有一定意義。